导语
日前，上海合乐888治疗集团关于低毒高效的新一代基因写入系统的最新研究希望入选2024年第27届美国基因与合乐888治疗学会（ASGCT）年会。ASGCT建设于1996年，是全球最大的专业从事基因和合乐888治疗研究的非赚钱性学术组织。ASGCT年会是全球基因和合乐888治疗领域规模最大的学术聚会会议，为与会者提供了一个先容最新基因与合乐888治疗的国际平台。ASGCT大会每年吸引全球各地数以千计的学者、科学家、医生、FDA官员、工业界代表、投资人加入。上海合乐888治疗集团团结扬州大学报道了一种全新、有用且清静的基因写入系统--JL 转座子系统，该 JL转座酶和太质粒的JL转座子系统具有高转座效率和低DNA合乐888毒性特征，基于JL转座子系统制备的CAR-T合乐888具有合乐888活率高、癌变风险低以及肿瘤合乐888杀伤活力强的特点。现在上海合乐888治疗集团使用该系统正在开展30小时快速型CAR-T合乐888生产工艺研究及临床研究探索。
摘要号 - P737
摘要问题
The JL Transposon System: A Novel, Efficient, and Safe Tool for Gene and Cell Therapy with Lower Cytotoxicity and Enhanced Transposition Efficiency
摘要内容
将外源基因高效递送至靶合乐888，保持恒久稳固表达，并尽可能地镌汰合乐888和基因毒性一直是基因治疗领域内所面临的挑战。基于DNA转座子的外源基因递送同样面临上述问题，需要进一步提高转座整合效率和降低DNA使用剂量从而降低合乐888毒性。
图 1 高效率及高清静性JL转座系统开发战略
上海合乐888治疗集团团结扬州大学通过大数据基因组剖析从三棘鱼（Gasterosteus aculeatus）基因组内发现了新型PS转座子，接纳定向进化的多种手艺手段获得了新型高效的JL转座子系统，已实现了比野生型PS转座酶高十余倍的效率提升。与此同时，我们还开发了无抗生素太质粒DNA（Tiniplasmid）生产系统，通过最小化骨架DNA，促进合乐888核转导效率，进一步提高了JL基因写入系统整体效能。
图 2 工程化高效PS 转座酶。A. SWISS-MODEL 通过自动同源建模手艺天生 PS 转座酶二聚体理论模子；B. 工程高效PS 转座酶（以 JL 转座酶为例）结构域组织示意图；C. 评估差异工程化 PS/JL 转座酶变体在 CHO 合乐888中转座效率提高。
为了更好评估JL基因写入系统在GCT领域的应用潜力，在本次ASGCT的Poster文章中，我们对基于JL转座子举行CAR-T合乐888制造的生物学特征举行了周全评价。研究效果批注，JL 转座子系统在一律条件下比 PiggyBac (PB) 和睡尤物 (SB) 等经典系统具有更高效的转座效率，同时还可实现低质粒剂量和低T合乐888合乐888毒性，高CAR-T 增殖活性。
图 3 以转座酶 mRNA 和转座子 Tiniplasmid® 制备CAR-T的优势。A. Tiniplasmid 的示意图；B-C. 与尺度质： PB 转座酶 mRNA 相比，Tiniplasmid 和 JL 转座酶 mRNA 具有更高的转座效率、更低的合乐888毒性和更快的合乐888增殖特征。
图 4 基于 MSLN CAR 的 JL 转座子系统的体外评估。A. MSLN CAR-T 的制备和检测流程图；B. 第 9 天 CAR+ 表达的T合乐888转座效率评价图；C. RTCA 检测显示 MSLN CAR-T 合乐888与肿瘤靶合乐888以 1:2 的 E:T 比例共作育 24/48/72 小时后的 MSLN 特异性合乐888毒性。NT为对照（n=7）。
为了研究潜在的遗传毒性，我们使用荧光素酶测定较量了 JL 和传统转座子系统之间的最后反向重复 (TIR) 非特异性启动子活性。效果批注，JL系统的28bp TIR为现在发现的最短转座子TIR序列，具有最低的非特异性启动子活性，对内源性基因滋扰最小。
图 5 超短型TIR 及其非特异性启动子活性。A. 在普遍应用于 GCT 的转座子中，JL 转座子的 28 bp TIR 序列是最短的，这很是有利于减小转座子质粒的大。佣岣咦剩籅. 此外，与其他转座子相比，JL 转座子的 TIR 相关非特异性启动子活性最低。SB：睡尤物转座子 TIR，PB：PiggyBac转座子TIR，JL-PS：Passer转座子TIR。
此外，我们使用毗连子介导的靶标扩增 PCR (LTA-PCR)、二代测序和生物信息学工具举行了全基因组整合位点剖析 (ISA)，以剖析 JL 转座子的整合位点特征。效果批注，675 个奇异的整合位点随机漫衍在整个基因组中，IS 没有在转录起始位点 (TSS)周围的偏好性。平均而言，69.14% 的奇异整合位点 (UIS) 发生在基因内（79.67% 在基因 ± 10 kb 内），其中绝大多数插入位点在内含子区。所有与癌症相关基因相关的位点的相对计数比低于0.5%，而且在整合位点内没有发现与已知的合乐888和基因治疗不良事务相关的基因。此外，从上述插入位点剖析效果来看，没有发现整合群集性热门。
图 6 使用毗连靶标扩增 PCR（LTA-PCR）绘制的 JL 转座子整合图谱和 UISs 的全基因组图谱。A. 样本中检测到的十个代表性最强的 UISs 的累积频率；B. 多克隆-单克隆距离（PMD）剖析。克隆多样性凭证雷尼熵举行评估，PMD 剖析基于两个因素：匀称度和富厚度。
C. 载体整合在染色体中的漫衍；D. 载体整合在转录起始位点周围的漫衍。硅学：盘算机模拟的随机整合参考。
E-F. 载体整合在基因区的漫衍。E：基因内或基因内 ±10 kb。F：在外显子或内含子中。
G. 癌症相关基因 TSS 上下游 100 kb 规模内 IS 的相对孝顺；H. 所有检测到的配合整合位点直观显示的载体整合热门漫衍。每个蓝色圆圈代表一个点；红色文字显示整合热门基因名称。
结论：
1. 基于同源守旧性的半理性设计PS 转座酶突变体，和亮氨酸拉链融合卵白战略，我们获得了一个工程化高效JL 转座酶和转座子系统。
2. 基于工程化高效JL转座酶mRNA和太质粒的转座子系统具有高转座效率和低DNA合乐888毒性特征。
3. 基于JL转座酶系统制备的CAR-T合乐888具有很强的杀伤肿瘤合乐888的能力。
4. 基于JL转座酶系统制备的CAR-T 合乐888具有低基因毒性和高清静性。
这些研究批注，JL 转座子系统是基因和合乐888治疗的一种全新、有用且清静的新型递送要领，而且是未来研究和临床应用的有前途的工具。
